글루코사민은 glycosaminoglycans, proteoglycans, 그리고 연골의 hyaluronan에 자연적으로 존재하는 아민성 단당류이다. 다양한 음식물(게, 굴, 새우 껍질 등)에 풍부한 것으로 알려져 있다. 인체에서의 합성은 나이가 들어감에 따라 점차 감소하는 것으로 알려져 있다. 천연으로는 키틴을 비롯하여 세균의 세포벽, 동물의 연골이나 피부를 구성하는 뮤코다당 등 다당류의 성분으로 널리 분포한다. 또한, 골관절염이나 상해로부터의 손상을 보수하기 위해 필요한 물질을 관절에 제공하여 특히 연골에서 발견되는 글리코사미노글리칸(glycosaminoglycan)이라 불리는 뮤코다당류를 만드는 물질이며, 그 외 소화기, 순환기 내의 기초점막, 관절부위의 활액, 인대 및 건을 포함한 신체조직의 대부분을 이루는 물질이다¹⁾.

글루코사민은 천연물질 외에도 황산염(glucosamine sulfate, GS)이나 염산염(glucosamine hydrochloride) 형태로 합성되어 사용되고 있다. 글루코사민은 임상적으로 관절염(osteoarthritis)의 증상에 유익한 효과가 있다는 일부 보고2,3)에 따라서 일반인에게 건강보조식품으로 광범위하게 섭취되고 있는 실정이다. 관절연골의 구성성분이므로 연골보호 효과가 있을 것이라는 수준의 논리뿐 아니라, 최근에는 글루코사민이 염증 반응 자체에 대한 억제효과가 있다는 연구결과가 보고된 바 있다^4,5). 그러나 글루코사민의 항염증 작용 기전에 대한 자세한 연구는 매우 드물다. NF-kB 의존적인 세포내 신호전달과정이 억제된다는 보고가 있으나^6,7) 그 외에는 잘 알려진 바가 없다. 최근의 흥미로운 연구결과로는 글루코사민과 그 대사물이 transglutaminase-2를 억제함으로써 간접적인 메커니즘으로 NF-kB의 활성을 억제하는 것이 항염증 기전을 설명할 수 있다는 보고가 있다⁸⁾.

만성염증 및 면역반응을 담당하고 있는 세포들, 특히 T 림프구의 신호전달과정 중에서 새롭게 주목 받고 있는 것으로 세포막을 통한 칼슘 유입과 이온통로가 있다. 면역세포 활성화의 가장 중요한 신호기전의 하나는 지속적, 또는 주기적 패턴의 세포내 칼슘농도([Ca²⁺]_i) 증가이다. 면역세포에서 phospholipase C (PLC) 등에 의한 세포내 저장고의 칼슘동원 및 이에 뒤따르는 칼슘유입은 거의 모든 종류의 면역세포에서 다양한 활성반응을 시작하게 하는 근본적인 신호이다⁹⁾. Ca²⁺은 거의 모든 유핵세포에서 중요한 2차 전령물질이지만, 림프구를 비롯한 면역세포의 분화, 엑소사이토시스, cytokine 생산, 면역시냅스생성 등에서 특히 중요하다. [Ca²⁺]_c의 증가는 두 가지 경로로 일어난다. (1) 세포내 저장고(endoplasmic reticulum, ER)로부터 IP3 수용체를 통한 유리(Ca²⁺ release)와 (2) ER의 칼슘저장 고갈(Ca²⁺ depletion)이 신호가 되어 활성화되는 칼슘통로(Ca²⁺-release activated Ca²⁺ channel, 일명 CRAC channel)이 있다⁹⁾. CRAC channel의 분자적 정체는 2006년 이후 일련의 발견에 의하여 Orai (또는 CRACM)이라고 명명된 세포막단백질에 대한 유전자가 클로닝되면서 밝혀졌다. 이와 함께, ER의 칼슘저장상태(또는 고갈상태)를 감지하여 CRAC을 활성화시키는 STIM1이라는 단백이 ER 지질막에 발현되어 있는 것이 필수적임이 밝혀졌다⁹⁾. 림프구나 비만세포 등에 높이 발현되어 있는 CRAC channel을 통한 Ca²⁺ 유입은 면역 반응 유발과 지속에 매우 중요한 역할을 한다. 이러한 사실은, Orai1이나 STIM1의 돌연변이가 사람에게서 심한 선천적 면역결핍을 일으키거나, 생쥐에서 알레르기 반응이 소실되는 등의 결과에서 명확히 드러난 바 있다⁹⁾.

면역세포의 CRAC channel과 함께 면역질환의 표적으로 주목 받고 있는 것으로 포타슘통로가 있다. 면역세포에 공통으로 존재하는 포타슘통로는 Kv1.3 (voltage-gated K⁺ channel의 일종)과 I_KCa1 (세포내 칼슘농도의 증가에 따라 활성화되는 Ca²⁺-activated K⁺ channel의 일종, SK4라고도 불림)이다. 음성으로 과분극(hyperpolarization) 막전압을 발생시키는 포타슘통로의 생리적 역할에 따르면, 이들의 활성화는 CRAC channel을 통한 칼슘의 유입을 강화시키는데 있어서 중요하다¹⁰⁾. 즉, 면역세포의 칼슘통로(CRAC)가 열린다 하더라도, 일방적인 양이온(Ca²⁺)의 유입은 세포막의 탈분극(depolarization)을 가져오면서 지속적인 유입에 스스로 제한을 두게 된다. 하지만 이러한 탈분극에 따라서 Kv1.3이 활성화되고, 또한 칼슘유입에 따라서 I_KCa1/SK4이 활성화되어 과분극을 유지하게 되면 비로소 지속적인 칼슘유입과 면역세포 활성화가 가능해진다. 더욱이 최근에는 Kv1.3이 단순한 이온통로의 역할 뿐만 아니라, 면역세포 신호전달체계에서 중요한 스캐폴더의 역할을 하는 가능성¹¹⁾이나 생체내 에너지대사 균형에도 관여하는 것이 보고되고 있다¹²⁾.

글루코사민에 의한 이온통로 및 칼슘신호의 조절에 대한 연구는 매우 드물다. ADP에 의한 혈소판 활성화에 대하여 글루코사민은 억제적 효과를 가지는데, 혈소판 활성화에 필수적인 신호인 세포내 칼슘증가를 감소시킨다고 보고되었다¹³⁾. 또한 뇌의 미세교아세포(microglia cell)에서 lipopolysaccharide(LPS)로 유도되는 세포내 칼슘 증가와 포타슘 외향전류가 글루코사민에 의하여 억제된다는 최근의 보고¹⁴⁾는 항염증 효과에 대한 새로운 기전의 가능성을 제시하였다. 본 연구에서는 이러한 배경지식과 최근 보고들을 바탕으로 human T 림프구 세포주인 Jurkat T cell에서 fura-2 형광분광법 및 팻취클램프 기법을 활용하여 세포내 칼슘신호 및 막전압의존성 K⁺ channel을 기록하고 이에 대한 글루코사민의 작용을 관찰하였다.

T 림프구의 안정상태 칼슘농도(resting [Ca²⁺]_c)는 80~120 nM 정도의 값을 보인다. Glucosamine 투여 자체는 이에 대하여 별다른 영향을 미치지 않았다. T 세포 수용체(TCR) 자극을 위하여 anti-CD3 Ab (5 μg/mL)를 투여하였다. 세포 내 칼슘농도는 그림1A와 같이 일과성의 상승 후에 일정 수준의 증가상태가 유지되는 모습을 보였다. 글루코사민 하이드로 클로라이드(GH) 500 μM을 전처치한 조건에서 TCR 자극은 대조군과 유사한 칼슘증가반응을 유발하였다(그림 1B). 장기간의 글루코사민 처리 후 TCR 자극에 의한 칼슘신호의 변화여부를 비교하여 보았다. 세포배양액에 100 μM 글루코사민을 첨가하고서 48시간 동안 배양 후, TCR 자극에 의한 칼슘신호를 관찰하였을 때 대조군에 비하여 유의한 차이를 발견할 수 없었다(그림 1C).

T 림프구에서 기록되는 voltage-dependent K⁺ current (I_Kv)에 대한 글루코사민의 작용을 관찰하였다. Whole-cell mode의 팻취클램프 기록 상태에서 막전압을 -80 mV에서 유지하다가 일정한 기울기의 탈분극 자극(ramp-pulse protocol)을 가하였을 때 기록되는 막전류를 전압에 대하여 도시하면 그림 2A와 같다. 이러한 전류-전압관계(I-V curve)에서 외향전류(수평선 위쪽으로 기록되는 전류)의 크기는 -30 mV에서 급격하게 상승하는 모습을 보였으며, 이는 막전압의존성 K⁺ 전류(I_Kv)의 전형적인 모습이었다. 글루코사민(500 μM)의 투여는 이러한 외향전류에 아무런 영향을 주지 않았다(그림 2A). 0 mV에서 측정한 외향전류 크기를 대조상태와 글루코사민 처치 상태에 대하여 각각 통계 값으로 정리하여 그림 2B에 정리하였다.

위의 결과를 볼 때, 글루코사민은 T 림프구의 칼슘신호 및 Kv channel에 대하여 직접적인 급성 효과는 없는 것으로 생각되었다. 다음 단계로서, 글루코사민을 48시간 이상 세포배양액에 추가한 후 포타슘 통로의 변화 여부를 관찰하였다. 배양액에 글루코사민(100 μM)을 첨가하고서 48시간 후에 기록되는 I_Kv의 경우에도 의미있는 변화는 관찰되지 않았다(그림 3A). T 림프구의 막전압을 -60 mV에 고정하였다가 -50 mV로 순간적으로 변화시킨 상태에서 150 ms 동안 탈분극시킨 다음, 다시 원래의 유지전압(-60 mV)으로 되돌아왔다. 이러한 Step-pulse를 10초마다 반복하면서, 탈분극수준을 10 mV씩 높였다. 최종적인 탈분극자극이 +60 mV에 도달할 때까지 시행하였다(그림 3B~3D의 우측 상단에 표시된 pulse protocol 참조). 각 세포에서 이러한 막전압자극에 반응하여 나타나는 외향전류들을 겹쳐서 도시하였다(그림 3B~3D). 그림 3A는 이러한 반응들을 통계적으로 정리한 전류-전압관계 곡선이다. 즉, 각 탈분극 자극전압에서 기록되었던 전류의 최대크기들을 모아서 통계값으로 정리한 다음, 전압값에 대하여 도시한 것이다.

T 림프구에 대한 TCR자극이 24시간 이상 지속되면 T 세포 이온통로의 발현, 특히 I_Kv의 증가가 일어날 수 있다는 고전적인 보고가 있다¹⁶⁾. 우리의 실험에서는 anti-CD3 Ab를 이용한 장시간 자극(>24~36 h)이 I_Kv의 크기를 2.5~3배 가량 증가시킨다는 것을 발견하였다. 이러한 TCR 자극에 의한 Kv발현 증가는 면역세포의 기능강화와 밀접한 관련이 있을 것으로 예상되었다. 따라서 이 현상에 대한 글루코사민의 작용을 관찰하였다. anti-CD3 Ab (5 μg/mL)와 함께 글루코사민(100 μM)을 함께 장시간 투여하였을 때에도 CD3 자극에 의한 I_Kv 증가는 여전히 일어났다. 그런데 비록 통계적으로는 유의하지 않았으나 TCR 자극만을 하였을 때에 비하여 I_Kv의 증가 정도가 약화되는 경향을 관찰할 수 있었다(그림 3).

마지막으로, T 림프구의 막전압조절 및 면역반응 조절에 중요한 역할을 할 수 있는 칼슘의존성 포타슘통로(K_Ca)에 대한 글루코사민의 작용을 살펴보았다. 면역세포에 발현되는 K_Ca는 I_KCa1/SK4 아형에 속하는 것으로 잘 알려져 있다^10,17). 본 연구의 재료였던 Jurkat T cell은 I_KCa1/SK4 의 발현이 매우 낮은 상태였기 때문에 이 실험의 대상으로 적절하지 않았다. 따라서 I_KCa1/SK4를 과발현시킨 세포주(HEK293)를 대상으로 inside-out patch 조건에서 실험을 수행하였다. 세포막 안쪽의 칼슘농도를 일정하게 유지시킨 상태에서 글루코사민의 효과를 정확하게 관찰하기 위하여 inside-out patch clamp 조건에서 실험을 수행하였다. Inside-out patch 조건에서 Ca²⁺-free 조건에서는 별다른 외향전류가 관찰되지 않았으나, 1 μM의 Ca²⁺이 존재하는 KCl 용액을 투여하면 외향전류가 크게 증가되었으며, 이것의 전류-전압곡선은 -85 mV에서 역전되는 경향을 보여서 K⁺에 선택적인 전류임을 확인할 수 있었다. 이처럼 I_KCa1/SK4이 활성화된 상태에서 글루코사민 500 μM을 투여하였을 때 I_KCa1/SK4의 전류크기는 적은 폭이지만 유의하게 감소하였다(n=4, 그림 4A, 4B).

본 연구에서는 글루코사민이 T 림프구에서 관찰되는 포타슘 이온통로 및 칼슘신호에 대한 억제효과를 가지는지 시험해 보았다. 서론에서 언급한 바와 같이, 글루코사민의 항염증효과가 이온통로 등을 매개로 일어날 가능성을 염두에 둔 실험이었다. 최근에 혈소판과 microglia cell^13,14)에서 칼슘신호에 대한 억제효과가 일부 관찰된 보고들이 그러한 가능성을 시사하였다. 그러나 본 연구의 결과들은 글루코사민은 T 림프구의 칼슘신호와 Kv current에 의미있는 직접효과가 없음을 보여주었다. 다만, 칼슘의존성 포타슘통로인 I_KCa1/SK4에 대하여 약간의 억제효과가 있음을 확인할 수 있었다.

T 림프구의 수용체(TCR) 자극을 유발하는 실험적 조건인 anti-CD3 Ab 투여는 처음의 빠른 일과성 칼슘농도 증가(initial Ca²⁺-transient) 후에 비교적 일정한 수준의 칼슘증가상태 유지(Ca²⁺-plateau)가 관찰되는 특성을 보인다. 이러한 변화는 각각 IP3-induced Ca²⁺ release와 store operated Ca²⁺ entry (SOCE)가 주된 메커니즘인데, 글루코사민은 이 두 반응에 모두 아무런 영향이 없었다. 본 연구결과에는 제시하지 않았으나, B 림프구의 칼슘신호에 대하여도 글루코사민의 작용여부를 테스트해 본 바 있었으며, mouse B 림프구 세포주인 WEHI-231과 Bal-17 모두에서 글루코사민(0.1~0.5 mM)은 유의한 작용을 보이지 않았다(data not shown).

결과에 기술한 바와 같이, I_Kv에 대한 글루코사민의 직접 효과는 없었으나, 한 가지 흥미로운 사실은 TCR 장기자극에 의한 I_Kv의 증가현상이 글루코사민으로 일부 둔화되는 경향을 보인 점이다. T 림프구의 이온통로에 대한 초기 연구결과들을 보면, mitogen을 투여하여 T 림프구를 자극시키면 I_Kv의 발현 정도가 증가한다는 현상이 보고된 바 있다¹⁶⁾. 이후 이 현상에 대한 자세한 연구는 수행되지 않았으나, Kv1.3의 발현 증가로부터 미루어, 이에 대한 차단제가 T 림프구를 매개로 하는 면역반응을 줄여줄 가능성에 주목하게 되었다^18,19).

본 연구결과에서는 PMA와 ionomycin이 아닌, 보다 생리적 자극인 anti-CD3 Ab를 이용한 T 림프구 자극에서 동일한 효과를 관찰할 수 있었다. 글루코사민을 병행 처리한 군에서는 비록 통계적으로 유의하지는 않으나, 그러한 K⁺ current 증가 효과가 음전압범위에서 둔화되는 경향을 보였다. 실제로 생리적 조건에서 I_Kv의 활성화를 일으킬 수 있는 세포막전압 범위는 -50 mV에서 -10 mV에 위치할 것으로 사료된다. 그러한 면에서 볼 때 글루코사민 장기투여의 효과는 흥미로운 점이 있다. TCR 자극, 특히 T 세포와 항원제시세포들 간의 자극은 세포막의 소위 ‘lipid raft domain’으로 주요 신호전달 분자들이 결집하는 것을 유도한다. 이러한 신호전달분자 군집(signaling complex) 형성에는 Kv 1.3 channel이 함께 중요한 역할을 한다는 보고가 있다¹¹⁾. 비록 자세한 세포생물학적 연구는 수행되지 못하였으나, 글루코사민의 48시간 전처리는 세포내 신호전달계를 억제하는 등의 효과를 통하여 I_Kv에 기능적 영향을 미칠 가능성을 배제할 수 없었다. 하지만 이 부분에 대하여 보다 자세한 추가 연구가 필요한 실정이다.

Kv1.3과 같은 면역세포의 voltage-gated K⁺ channel은 면역 반응 제어 및 조절의 중요한 타겟으로 주목 받고 있다. K⁺ channel 저해제가 다양한 전임상 실험에서 효력을 지님을 입증하는 결과들의 예로는 Kv1.3 차단제가 T cell-mediated autoimmune disease의 치료, 특히 다발성경화증(multiple sclerosis)에 대한 효과가 있음을 전임상 실험 등에서 보여주었다^18,19). 또한 치주염에서 K⁺ channel 차단제의 효과가 제시되었다²⁰⁾. 심지어 Kv1.3의 경우에는 에너지대사와 비만방지의 가능성에 대한 제시도 함께 되고 있다¹²⁾.

Kv1.3뿐만 아니라 I_KCa1/SK4 또한 면역자극에 의하여 장기적으로 발현이 증가되며 이에 대한 차단제가 면역억제효과가 있다는 보고가 있다²¹⁾. I_KCa1/SK4는 Kv1.3과 함께 lipid raft에 국소적 분포가 관찰된다¹⁷⁾. 이러한 면에서 볼 때 비록 본 연구에서는 약한 억제효과를 관찰하는데 그쳤으나, T 림프구의 I_KCa1/SK4 channel에 대한 글루코사민의 조절효과를 찾는 더 강화시킬 수 있는 조건을 찾는 연구는 흥미로운 임상적 해석이 가능할 수 있을 것으로 사료된다.